Główna funkcja L-karnityny jest bezpośrednio związana z transportem kwasów tłuszczowych z cytoplazmy do wnętrza mitochondriów, czyli do tzw. centrów energetycznych komórki.  

Karnityna występuje w organizmie w postaci dwóch izomerów optycznych: o konfiguracji względnej D lub L. Jednak tylko forma L wykazuje aktywność biologiczną i w tej postaci karnityna powinna być obecna w codziennej diecie lub suplementowana.

L-karnityna pełni ważną rolę w metabolizmie lipidów, ponieważ transportuje długołańcuchowe kwasy tłuszczowe do mitochondriów, gdzie ulegają one przemianom (beta-oksydacji), w wyniku których powstaje energia niezbędna do funkcjonowania komórek. L-karnityna jest zatem transporterem hydrofobowych cząsteczek przez nieprzepuszczalną dla nich błonę mitochondrialną. Równocześnie usuwa z mitochondriów krótko- i średniołańcuchowe kwasy tłuszczowe, które w zbyt dużym stężeniu wykazują działanie toksyczne. Dodatkowo wykazuje zdolność do obniżania poziomu cholesterolu i triacylogliceroli.

Oprócz udziału w metabolizmie lipidów L-karnityna uczestniczy w metabolizmie rozgałęzionych aminokwasów (waliny, leucyny, izoleucyny) oraz w przemianach węglowodanów. Ma również działanie antyoksydacyjne, chroni komórki przed działaniem reaktywnych form tlenu, a tym samym stabilizuje błony komórkowe i dba o prawidłowe działanie kanałów jonowych. Chroni m.in. błony erytrocytów i naczynia krwionośne, dzięki czemu nie dopuszcza do rozwoju zmian miażdżycowych. Ma zdolność do chelatowania niektórych pierwiastków (np. żelaza, ołowiu, kadmu), umożliwiając ich transport i usuwanie ich nadmiaru z organizmu.

Pozostałe funkcje biologiczne L-karnityny obejmują: 

• stabilizację błon komórkowych (np. erytrocytów), 
• transport długołańcuchowych kwasów tłuszczowych pomiędzy peroksysomami a mitochondriami, 
• działanie antyoksydacyjne, 
• regulację stężenia wewnątrzkomórkowego żelaza, 
• usuwanie z organizmu niektórych leków, 
• udział w metabolizmie aminokwasów rozgałęzionych (waliny, leucyny i izoleucyny), 
• udział w niektórych przemianach węglowodanów, np. poprzez zmniejszenie wykorzystywania glikogenu jako materiału energetycznego.